徕卡显微镜荧光染料
在荧光显微镜的基本原理是用荧光剂的帮助细胞成分的高度特异性的可视化。 这可以是一个荧光蛋白-例如绿色荧光蛋白 -遗传连锁到感兴趣的蛋白质。 如果克隆是不可能的 - 例如组织学样品中的 - 它是需要使用其他技术，如免疫荧光染色来可视化目的蛋白质。 用于此目的的抗体的利用，这是直接或间接地连接到不同的荧光染料和结合到适当的目标结构。 另外，用荧光染料荧光显微镜的帮助下，不于蛋白，但它也使染色核酸，聚糖和其它结构的机会。 像钙离子甚至非生物物质可以被检测出来。 本文介绍了常用的荧光剂。在荧光显微镜有两种方式来可视化你感兴趣的蛋白质。无论是与固有荧光信号的帮助 - 通过克隆，因此荧光蛋白基因链接到目标蛋白的手段。或借助荧光标记的特异性结合到感兴趣的蛋白质的抗体。对一些生物学问题是比较有用，甚至必要执行后者。在组织学样品的情况下，例如，它是不可能使用荧光蛋白，因为在一般的样品由不持有任何荧光蛋白质的生物来源。此外，如果一个正常运作的抗体可用，免疫荧光比荧光蛋白技术快很多，是你有兴趣和转染的DNA基因克隆到足够的细胞。荧光蛋白的另一缺点在于它们的存在的蛋白质本身的性质。有了它，他们有一个细胞，其可导致功能障碍或误解关于感兴趣的附着蛋白中的特定蛋白质性特征。然而，应当考虑到使用荧光蛋白通常是选择的方法来观看活细胞。
免疫是利用抗体与其抗原的非常特异性结合亲和力的。这可以有两种不同的外观。的方法是使用一种荧光标记的抗体被结合到感兴趣的蛋白质。这就是所谓的直接免疫荧光 。
在大多数情况下，有使用了两种形式的抗体。个结合靶蛋白和未荧光标记的自身（第1抗体）。但是这是结合1 次抗体的第二个（2 次抗体）特异性携带荧光染料。这种方法被称为间接免疫荧光和具有几个优点。一方面有一个放大效应，因为多于一个的2 次抗体结合一种1 次抗体。另一方面，没有必要所有的时间来标记各抗体对你最喜爱的蛋白与荧光染料，但可以利用商业荧光标记的第二抗体。 对于免疫荧光广泛使用的荧光染料是FITC，TRITC或几个的Alexa Fluor®它们在下面提及的染料。
异硫氰酸荧光素（FITC）是有机荧光染料这仍然是在免疫荧光和流式细胞仪使用。它在五百十七分之四百九十五处具有一个激发/发射峰并可以耦合到不同的抗体与它的反应性异硫氰酸酯基，其结合至氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰或羰基上的蛋白的帮助。其基本形式- 荧光素 -具有332克/摩尔的摩尔质量和通常用作荧光示踪剂FITC（389克/摩尔）为其用于荧光显微镜的染料中的一种，并作为进一步的原点。荧光染料一样的AlexaFluor®488。其荧光活性是由于其大的共轭芳族电子系统，它是由光在蓝色光谱激发。
很多时候同日而语用FITC使用的染料是其发音相似的伙伴TRITC（Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate）。在对比FITC，TRITC不是荧光素，但罗丹明家族的衍生物。罗丹明也有大量的共轭芳族电子系统，是什么导致了他们的荧光行为。相反，FITC，TRITC（479克/摩尔）是兴奋与550纳米的绿色光谱的光。 其发射躺在在573纳米。 键合到蛋白质（例如抗体）也基于反应性异硫氰酸酯基团。
即使FITC和TRITC仍然在使用，他们推荐的艺术显微镜的状态，而弱荧光染料和不。他们的利润是根据自己的经济代价。
Cy2，Cy3，Cy5和Cy7：这个相对较小的荧光染料的收藏是从花青这也是因为他们的名字由来的。所有的人都可以通过它们的反应性基团被连接到核酸或蛋白质。对于蛋白质性标记马来酰亚胺基团的使用，例如。 有趣的是 - 关于荧光 - Cy5的是它的电子周边敏感。这可以用于酶测定。附着蛋白引线构象变化，以在荧光发射的正或负改变。此外Cy3和Cy5可用于FRET实验。花青染料是比较老的荧光染料和为具有改进的亮度，耐光性，量子产率等其他荧光染料的基础
Alexa Fluor®染料是其中使用非常经常在荧光显微镜负电荷和亲水性荧光染料的一个大的基团。他们的称谓可以追溯到它的理查德·保罗·格兰谁命名他的儿子亚历克斯毕浩然后的染料。这个标签是分子探针（的子公司的商标寿命技术）。此外，各激光激发波长是在其标签提及。例如非常广泛使用的Alexa Fluor®488具有493纳米，它允许励磁用标准488 nm激光激发值。Alexa Fluor®488具有519纳米的发射。有了这个特性，Alexa Fluor®488具有非常相似的特性FITC。虽然的Alexa Fluor®488是荧光素衍生物，而相比之下，FITC它具有更好的稳定性，亮度和较低的pH敏感性。所有的Alexa Fluor®染料的荧光素一样，，花青或罗丹明不同的基本荧光物质（如的Alexa Fluor®546 ,Alexa Fluor®633）磺化形式。它们的摩尔质量范围从410至1400克/摩尔。
在荧光显微镜不仅蛋白质结构的利益，而且核酸。有时，有必要通过检测其细胞核以限定细胞的确切位置或数量。其中见的DNA污斑是DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基），其结合到在DNA双螺旋的丰富的区域。如果连接到DNA相比，其未绑定状态DAPI荧光强度增加。它通过UV -light与358纳米的激发。发射谱很广，在461 nm的峰值。弱荧光也可以为RNA结合检测。在这种情况下，发射转移到500纳米。有趣的是，DAPI能够渗透完整质膜。因此，它可以在固定的，以及在活细胞中使用。
第二个广泛使用的DNA染色方法是赫斯特染料，它最初是由化工公司赫斯特公司生产的家人。赫斯特33258，赫斯特33342和赫斯特34580是双- benzimides与嵌入倾向AT丰富的地区，于是后者不经常使用。以DAPI类似它们是由紫外线 -light并在其移动到510-540纳米未绑定状态455nm的发射激发。Hoechst的污渍也细胞渗透性，因此可以在固定和活细胞一起使用。以DAPI的差别就是其较低的毒性。
一种膜防渗DNA染色是碘化碘化。它，它通常被用于在细胞培养物中活的和死的细胞之间进行区分，因为它`吨输入完整的细胞。Propidium-碘也是嵌入剂，但与不同的碱基未结合偏好。在核酸结合状态，它的激发是在538纳米。发射是在617纳米。未结合的碘化-碘化物激发和发射值偏移到较低的波长和强度较低。它也可以结合的RNA，而不改变它的荧光特性。 区分的RNA的DNA，有必要使用适当的核酸酶。
其能够使没有先前操纵DNA和RNA之间的差的染料是吖啶橙。它激发/发射对是在DNA结合的版本，502纳米/ 525纳米和转向460纳米/ 650纳米的RNA束缚态。 此外，它能够进入酸性隔室象溶酶体。 有阳离子染料被质子化。 在这种酸性环境吖啶橙是由光的蓝色光谱激发，而发射是橙色区域的。 因为细胞凋亡有很多吞没酸性隔室的这使它成为各种细胞的经常使用的标记物。
在荧光显微镜它常常是合理的染色细胞区室像溶酶体或内体和细胞器像线粒体。为此，有这将在本节提到可用特定的染料的调色板。
一种公知的方法来观察线粒体是MitoTracker®的利用率。这是一个细胞渗透性染料与轻度硫醇反应性氯基部分。它，它可以共价通过用半残基的游离巯基反应结合基质蛋白。MitoTracker®存在于不同的颜色和修改（第表1）和是分子探针的商标。在对比像若丹明123或tetramethylrosamine，MitoTracker常规线粒体特定污渍®与固定剂的膜电位的破坏后，不洗出。
根据线粒体的污渍也有染料标记的酸性区室像被称为LysoTracker溶酶体。这些是连接到荧光团膜可渗透弱碱。最可能的是这些基地都因为质子化的酸性车厢的亲和力。LysoTrackers，可以在不同的颜色（第表1）。
一个可比车厢溶酶体是像酿酒酵母真菌液泡。这种膜封闭的空间是一种酸性性质也。形象化它在荧光显微镜的一种方法是使用基于苯乙烯基染料像调频4-64®或FM 5-95®的。
当涉及到蛋白质分泌实验内质网（ER）是一种特殊的兴趣。一个经典的染料染色这个车厢是DiOC6（3）。它有急诊室的偏好，但仍然结合到其他膜像线粒体。专门染色质的另一种方法是使用ER-跟踪器一样ER-跟踪绿色和红色。这两者都是链接到基BODIPY染料-一个sulfonylurease -结合到ATP敏感性钾通道的驻留在ER膜BODIPY（硼二吡咯亚甲基）描述了一组相对不敏感的pH值的染料其中几乎都是不溶于水的。这并不能让他们对蛋白标记，但脂质和膜标签的一个很好的工具。
相邻的隔间内质网-高尔基仪器 -可以用荧光神经酰胺类似物像NBD C6神经酰胺和BODIPY FL C5神经酰胺标记。神经酰胺是它们在高尔基体高度富集鞘脂类。
随着进一步的基于脂质染料的帮助下，可以进行染色样脂质筏特殊的膜的区域。 这些富含的域可以通过使用NBD-6或NBP-12除其他（可视化阿凡提极性脂质 ）。
除了使用特殊的非蛋白荧光染料标记的细胞区室，也可以染色的与蛋白质的帮助下与在小区的不同位置偏好感兴趣的区域。 这些蛋白质可以链接到一个荧光染料，并在荧光显微镜观察。 对于这种方法的一个例子是小麦胚芽凝集素（WGA）的特异性结合唾液酸和存在于质膜N-乙酰用法。 WGA耦合至荧光染料。 与它质膜可以观察到。
在神经元的研究中，基因的活性或细胞运动的情况下 - 例如 - 它是感兴趣了解的细胞的离子浓度。 钠，钙，氯离子或镁离子具有在许多不同的细胞事件的深刻影响。 通常，离子可被捕获与荧光标记的螯合剂，当结合到合适的离子改变它们的光谱特性的帮助。 这一原则在钙指标FURA-2，印度1，荧光- 3荧光- 4 和钙绿 ，例如实现。
用于检测钠，SBFI（sodium-binding benzofuran isophthalate）或绿色钠常用。PBFI（potassium-binding benzofurzanisophthalate）检测钾离子。
有趣的是也有基于蛋白质的钙指标。 其中之一是基于所述水母化学发光蛋白水母发光蛋白。水母发光蛋白的发光团腔肠素，分子氧和钙离子的相互作用导致蓝色光的释放-在一个非常突出的机构的荧光蛋白质的发现。
上面提到的所有染料都列出在下表中。 另外附加的荧光染料与它们激发和发射波长峰一起提及。
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