微生物限度检查法
微生物限度检查法（2005年版一部）附录ⅩⅢC. 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定**制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括**数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。 除另有规定外，本检查法中**培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。 检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml或10cm为单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品（g、ml 或 cm）。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加10g或10ml。 检验时，应从2个以上*小包装单位中抽取供试品，还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上*小包装单位）的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备*加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液*100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液*100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1 取供试品5g(5ml),加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液*100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。 方法2 取供试品10g，加*含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XIII B无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中 ，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5~10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。 （2）膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加50ml或100ml的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：10或1：20的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g ，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）*100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液。 （4）气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速**供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放*室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用吸出全部药液，加*适量的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。 （5）具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。 ①培养基稀释法 取规定量的供试液，*较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，*不含抑菌作用。测定**、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大的用量。 ②离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补*原量。 ③薄膜过滤法 见**、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。 ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。 **、霉菌及酵母计数 计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行**、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的**、霉菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。 验证时，按供试液的制备和**、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli) ［CMCC（B）44 102］ （Staphylococcus aureus)［CMCC（B） 26 003］ 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ) ［CMCC（B） 63 501］ 白色*** (Candidaalbicans) 黑曲霉 (Aspergillus niger ) 菌液制备 接种大肠埃希菌、、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物*营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物*改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物*改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）*无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。 验证方法 验证试验*少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的*低稀释级供试液1ml 和50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的*低稀释级供试液，过滤，冲洗，在*后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌数。 （2）菌液组 测定所加的试验菌数。 （3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌 落计数方法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使*终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的**、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的**、霉菌及酵母菌计数同时进行。 检查法 计数方法包括平皿法和 薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的**、霉菌及酵母菌菌数的测定。 取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：100、1：1000等稀释级。 1.平皿法 采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液。 取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基*少制备2个平板。 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。 培养和计数 除另有规定外，**培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间*5~7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 一般营养琼脂培养基用于**计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有**，则应分别点计霉菌和酵母菌、**菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的**数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的**数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。 菌数报告规则 宜选取**、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌宜平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 （1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 （2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值） 而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落乘以稀释倍数的值报告菌数，当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 （3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以*低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 （4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅*低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以*低稀释倍数的值报告菌数。 2.薄膜过滤法 采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径一般为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法**。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的*大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加*适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品没1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基*少制备一张滤膜。 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌 落数应超过100个。 菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。 控制菌检查 控制菌检查方法的验证。 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。 验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 菌种 对试验菌种的要求同**、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 大肠埃希菌（Escherichia coli) ［CMCC（B）44 102］ （Staphylococcus aureus)［CMCC（B） 26 003］ 乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B) ［CMCC（B）50 094］ 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC（B） 10 104］ 生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes) 菌液制备 接种大肠埃希菌、、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物*营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物*硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18~24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数 为10~100cfu的菌悬液。 验证方法 （1）试验组 取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在*后一次冲洗液中，过滤后，注入或取出滤膜接入中。 （2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用；验证铜绿假单胞菌、，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 检查法 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，的实际用量同控制菌检查方法的验证。 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照验的加菌量为10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 （1）大肠埃希菌（Escherichia coli) 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种*适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时，必要时可延长*48小时。 取上述培养物0.2ml，接种*含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙红琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。 若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，叛供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。 表1 大肠埃希菌菌落形态特征─────────────────────────────────── 培养基 菌 落 形 态─────────────────────────────────── 曙红 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色、菌落中心呈 琼脂 深紫色或无明显暗色中心、圆形，稍凸起，边缘整齐， 表面光滑，湿润，常有金属光泽─────────────────────────────────── 麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平， 边缘整齐，表面光滑，湿润─────────────────────────────────── （2）大肠菌群（Coliform) 取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1：100的供试液1ml （含供试品0.01g或 0.01ml ）、1：1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24小时。 胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18~24小时。 若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。 表2 大肠菌群落形态特征 ────────────────────────────────── 培养基 菌落形态───────────────────────────────────曙红琼脂 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平 或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润─────────────────────────────────── 麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平 或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润 ───────────────────────────────────确证试验 从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24~48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。 根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品 中的大肠菌群数。 表3 可能的大肠菌群数表──────────────────────────────────── 各供试品量的检出结果 可能的大肠菌群数─────────────────────────────── 群数N（个/g或ml） 0.1g或 0.01g或 0.001g或 0.1ml 0.01ml 0.001ml───────────────────────────────────────────────── + + + ＞1000 + + － 100 ＜N ＜1000 + － － 10 ＜N ＜100 － － － N ＜10──────────────────────────────────────────────────注：+代表检出大肠菌群； －代表未检出大肠菌群。 （3）沙门菌（Salmonella） 取供试品10g或10ml，直接或处理后接种*适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18~24小时。 取上述培养物1ml，接种于10ml四亮绿培养基中，培养18~24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基的平板上，培养18~24小时（必要时延长*40~48小时）。若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。 若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。 表4 沙门菌菌落形态特征──────────────────────────────────────────────── 培养基 菌 落 形 态───────────────────────────────────────────────── 胆盐硫乳琼脂 无色*浅橙色，半透明，菌落中心带黑色 或全部黑色或无黑色──────────────────────────────────────────────────沙门、志贺菌属琼脂 无色*淡红色，半透明或不透明，菌落中 心有时带黑褐色─────────────────────────────────────────────────── 曙红琼脂 无色*浅橙色，透明或半透明，光滑湿润 的圆形菌落───────────────────────────────────────────────────麦康凯琼脂 无色*浅橙色，透明或半透明，菌落中心 有时为暗色─────────────────────────────────────────────────── （4）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种*适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基**铵琼脂培养基的平板上，培养18~24小时。 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板上的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。 若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。 绿脓菌素（Pyocyanin)试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加3~5ml*培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将相移*另一试管中，加入1mol/l盐酸试液约1ml,振摇后，静置片刻，观察。若盐酸容易呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。 (5)(Staphylococcus aureus) 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种*适量（不少于100ml）亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18～24小时，必要时可延长*48小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出。 表5 菌落形态特────────────────────────────────────────────────────── 培养基 菌 落 形 态──────────────────────────────────────────────────────氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环， 菌落直径0.7~1mm────────────────────────────────────────────────────── 卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有 分解的乳浊圈，菌落直径1~2mm────────────────────────────────────────────────────── 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18~24小时，作血浆凝固酶试验。 血浆凝固酶试验 取**小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1：1）0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直* 24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。 若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出。 （6）梭菌（Clostridium） 取供试液10ml（相当于供试品1g，1ml）2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种*100ml的庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养72~96小时。如试验管不出现浑浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和酶试验。 酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%试液，若菌落表面有气泡产生，为酶试验阳性，否则为阴性。 若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。 结果判断 供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。 供试品的**数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。 眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。 若供试品的**数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。 稀释液 稀释液配制后，应采用验证合格的**程序**。 1.PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌检查法（附录 XII B）制备。 2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.6无菌磷酸盐缓冲液 按缓冲液（附录XV D）配制后，过滤，分装，**。 如需要，可再上述稀释液**前后或**后加入表面活性剂或中和剂等。 3.0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，**。 培养基及其制备方法 培养基可按以下**制备，也可使用按该**生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的**程序**。 1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基 照无菌检查法（附录 XIII B）制备。 2.玫瑰红钠琼脂培养基 胨 5.0g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10.0g 琼脂 14.0g 磷酸二氢钾 1.0g 水 1000ml 0.5g 除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，**。 3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD） 胨 10.0g 琼脂 14.0g 酵母浸出粉 5.0g 水 1000ml 葡萄糖 20.0g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，**。 4.胆盐乳糖培养基（BL） 胨 20.0 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g （或去氧胆酸钠） （0.5g） 4.0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠）外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.4±0.2，煮沸，澄清，加入乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠），分装，**。 5.胆盐乳糖发酵培养基 取未**的胆盐乳糖培养基1000ml，加入0.04%溴甲酚紫指示液25ml，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。**。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。 6.曙红琼脂培养基（EMB） 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20%乳糖溶液 5ml 指示液 1.3~1.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷*60℃，按无菌操作加入**的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。 7.麦康凯琼脂培养基（MacC） 胨 20.0g 1%中性红指示液 3ml 乳糖 10.0g 琼脂 14.0g 牛胆盐 5.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除乳糖、1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，**，冷*约60℃，倾注平皿。 8.4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glu-curonide,MUG）培养基 胨 10.0g 磷酸二氢钾（无水） 0.9g 硫酸锰 0.5mg （无水） 6.2g 硫酸锌 0.5mg 亚 40mg 0.1g 去氧胆酸钠 1.0g 氯化钠 5.0g MUG 75mg 硫酸钙 50mg 水 1000ml 除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，**。 9.三糖铁琼脂培养基（TSI） 胨 20.0g 0.2g 牛肉浸出粉 5.0g 硫代 0.2g 乳糖 10.0g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10.0g 琼脂 12.0g 葡萄糖 1.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后7.3±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，**，制成高底层（2~3cm）短斜面。 10.四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB） 胨 5.0g 硫代 30.0g 牛胆盐 1.0g 水 1000ml 碳酸钙 10.0g 取上述成分，混合，微温溶解，**。 临用前，取上述培养基，每10ml加入碘试液0.2ml 和亮绿试液0.1ml，混匀。 11.沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS） 胨 5.0g 硫代 8.5g 牛肉浸出粉 5.0g 中性红指示液 2.5 ml 乳糖 10.0g 亮绿试液 0.33ml 牛胆盐 8.5g 琼脂 16.0g 8.5g 水 1000ml 1.0 g 除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，**，冷*60℃，倾注平皿。 12.胆盐硫乳琼脂培养基（DHL） 胨 20.0g 1.0g 牛肉浸出粉 3.0g 1.0g 乳糖 10.0g 中性红指示液 3ml 蔗糖 10.0g 琼脂 16.0g 去氧胆酸钠 1.0g 水 1000ml 硫代 2.3 g 除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷*60℃，倾注平皿。 13.溴化十六烷基**铵琼脂培养基 胨 10.0g 溴化十六烷基**铵 0.3g 牛肉浸出粉 3.0g 琼脂 14.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化后，分装，**，冷*60℃，倾注平皿。 14.亚蹄酸盐肉汤培养基 临用前，取**的营养肉汤培养基，每100ml 中加入新配制的1%亚碲酸钠（钾）试液0.2ml，混匀，即得。 15.卵黄氯化钠琼脂培养基 胨 6.0g 10%氯化钠卵黄液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 琼脂 14.0g 氯化钠 30.0g 水 650ml 除10%氯化钠卵黄液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.6±0.1，**，待冷*约60℃，以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分振摇，倾注平皿。 10%氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个，以免菌操作取出卵黄，放入10%无菌氯化钠溶液100ml，充分振摇即得。 16.氯化钠琼脂培养基 胨 10.0g 酚磺酞指示液 2.5ml 牛肉浸出粉 1.0g 琼脂 14.0g 10.0g 水 1000ml 氯化钠 75.0g 除、磺指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.4±0.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，**，冷*60℃，倾注平皿。 17.乳糖发酵培养基 胨 20.0g 乳糖 10.0g 0.04%溴甲酚紫 水 1000ml 指示液 25ml 除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。**。 18.绿脓菌素（pyocyanin)测定用培养基（PDP琼脂培养基） 胨 20.0g 甘油 10ml 氯化镁（无水） 1.4g 琼脂 14.0g 硫酸钾（无水） 10.0g 水 1000ml 取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，**，置成斜面。 19.庖肉培养基 牛肉碎块的制备 取新鲜牛肉，除去脂肪和筋腱，加蒸馏水煮沸约10分钟，切成约5mm3的小块，称重，按1：3（肉：水）加蒸馏水，置4~10℃浸18~20小时后，煮沸1小时，用白布过滤（滤液即为1：3牛肉浸液），肉渣用自来水漂洗2次，然后加入适量溶液，搅拌，使PH在8.4左右，浸泡过夜，次日倾去上层水，用蒸馏水冲洗2~3次，放在纱布上，自动沥干（不要挤压）。将肉渣铺在搪瓷盘上，**，于80~100℃烘干，筛去碎屑，装瓶，保持干燥，备用。 庖肉培养基的制备 将上述碎肉块装入合适的容器中，再加入营养肉汤培养基，碎肉的量为1.5%，调节PH使**后为7.3±0.1。**。 20.哥伦比亚琼脂培养基 酪蛋白消化物 10.0g 肉胃酶消化物 5.0g 心消化物 3.0g 酵母浸出粉 5.0g 玉米淀粉 1.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值使**后为7.3±0.2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，**，冷*45~50℃，加入相当于20mg的无菌硫酸，混匀，倾注平皿。 试液 十四烷酸异丙酯 Isopropyl Myristate ［C17H34O2=270.46］ 本品为无色液体。溶于乙醇、、丙酮、或甲苯，不溶于水、甘油或丙二醇。约208℃分解。 二盐酸二甲基对苯二胺 N,N-dimethyl-p-phenylenedi-amine Dihydrochloride［C8H12N2.3HCL=209.12］ 本品为白色或灰白色结晶性粉末；置空气中色渐变暗；易吸潮。在水或乙醇中溶解。 溴化十六烷基**铵 Cetyl Trimethylammonium Bromide［C19H42BrN=364.46］ 本品为白色结晶。在水中溶解，在乙醇中微溶，在中不溶。 中性红Neutral Red ［C15H17N4Cl=288.78］ 本品为深绿色或宗黑色粉末。在水或乙醇中溶解。 牛肉浸出粉 Beef Extract Powder 本品为米黄色粉末，在水中溶解。 牛胆盐 Ox Bile Salt 本品为淡黄色或黄棕色粉末，味苦而甜，具吸湿性。在水或醇中易溶。 Mannitol ［C6H14O6=182.17］ 本品为白色结晶；味甜。在水中溶解，在乙醇中微溶。 4-甲基伞形酮葡萄苷酸 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glu-curonide,MUG［C18H16O9=376.3］ 本品为白色针状结晶。在水、乙醇或中溶解。在稀溶液中分解。 去氧胆酸钠 Sodium Deoxycholate ［C24H39NaO4=414.56］ 本品为白色结晶性粉末，味苦。易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。 亚碲酸钠 Sodium Tellurite ［Na2TeO3=221.58］ 本品为白色粉末。在热水中易溶，在水中微溶。 玫瑰红钠（四氯四碘） Rose Bengal Sodium Salt ［C20H2Cl4I4Na2O5=1017.6］ 本品为棕红色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。 单硬脂酸甘油酯 Glycerol Monostearte ［C21H42O4=358.56］ 本品为白色或黄色腊状。在热有机溶剂或矿物油中溶解，在水中不溶，但与水能乳化。 Sodium Citrate ［C6H5Na3O7.2H2O=294.10］ 本品为白色结晶或粉末。在水中易溶，在乙醇中不溶。 Ammonium Ferric Citrate ［C12H22FeN3O14=488.16］ 本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易溶解，见光易还原成亚铁。在水中溶解，在醇或醚中不溶。 胰蛋白胨 Tryptone 本品为米黄色粉末。在水中溶解。 硫酸锌 Zinc Sufate ［ZnSO4.7H2O=287.56］ 本品为白色结晶、颗粒或粉末。在水中易溶，在甘油中溶解，在乙醇中微溶。 硫酸锰 Manganese Sulfate ［MnSO4.H2O=169.02］ 本品为粉红色结晶。在水中溶解，在乙醇中不溶。 酪蛋白消化物（胰酪胨或酪胨） Pancreatic Digest of Casein 本品为黄色或浅黄色颗粒。以干酪素为原料经水解、活性炭脱色处理、精制而成。 试 液 二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml,即得。需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。 亚碲酸钠（钾）试液 取亚碲酸钠（钾）0.1g ，加新鲜煮沸后冷*50℃的水10ml使溶解。 玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠0.1g，加水使溶解成75ml。 亮绿试液 取亮绿0.1g，加水100ml 使溶解。 盐酸试液 取盐酸8.4 ml，加水使稀释成100 ml 。 靛基质试液 取对二甲氨基甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95 ml，充分振摇，使溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 碘试液 取碘6g与5g，加水20ml使溶解。 试液 取浓溶液（30%），加水稀释 成3%的溶液，临用时配制。 指示液 中性红指示液 取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水*100ml。 变色范围PH6.8~8.0（红→黄）。 指示液 取0.5g，加水使溶解成1000ml。 酚磺酞指示液 取酚磺酞1.0g，加1mol/L溶液2.82ml，使溶解，再加水*100ml。 变色范围PH6.8~8.4（黄→红）。 溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。 变色范围PH5.2~6.8（黄→紫）。 曙红钠指示液 取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。 微生物限度标准 非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无菌检查法规定。 2.口服给药制剂 2.1 不含药材原粉的制剂 **数 每1g不得过1000个。每1ml 不得过100个。 霉菌和酵母菌数 每1g或1ml 不得过100个。 大肠埃希菌 每1g或1ml 不得检出。 2.2 含药材原粉的制剂 **数 每1g不得过10 000个（丸剂每1g不得过30000个）。每1ml不得过500个。 霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml不得过100个。 大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。 大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。 2.3 含豆豉、神曲等发酵成分的制剂 **数 每1g不得过100 000个。每1ml不得过1000个。 霉菌和酵母菌数 每1g不得过500个。每1ml不得过100个。 大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。 大肠菌群 每1g应小于100个。每1ml应小于10个。 3.局部给药制剂 3.1 用于手术、**及严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。 3.2 用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂 **数 每1g或10cm2不得过1000个。每1ml不得过100个。 霉菌数和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2 不得过100个。 、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2 不得检出。 3.3 用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂 **数 每1g或10cm2 不得过10 000个。每1ml不得过100个。 霉菌数和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2 不得过100个。 、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2 不得检出。 3.4眼部给药制剂 **数 每1g或1ml不得过10个。 霉菌数和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2 不得检出。 、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌每1g、1ml 不得检出。 3.5耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 **数 每1g、1ml或10cm2不得过100个。 霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2 不得过10个。 、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2 不得检出。 大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂 每1g、1ml或10cm2不得检出。 3.6 **、尿道给药制剂 **数 每1g或1ml 不得过100个。 霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml 应小于10个。 、铜绿假单胞菌、梭菌 每1g或1ml 不得检出。 3.7 直肠给药制剂 **数 每1g不得过1000个。每1ml 不得过100个。 霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100个。 、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌 每1g或1ml 不得检出。 3.8 其他局部给药制剂 **数 每1g、1ml或10cm2 不得过100个。 霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm2不得过100个。 、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm2 不得检出。 4.含动物组织（包括提取物）及动物类原药材粉（蜂蜜、王浆、动物角、除外）的口服给药制剂 每10g或10 ml还不得检出沙门菌。 5.有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准。 6.霉变、长螨者 以不合格论。 7.中药提取物及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行。
页:
[1]