细胞共培养方法的研究进展
细胞共培养方法的研究进展 细胞培养的历史应追溯到 19 世纪 80 年代，德国学者WilhelmRoux 从鸡胚中分离细胞建立体外细胞培养；Earle 和 Dulbecco 于 1943 年创建了单层细胞培养。细胞培养技术于 20 世纪 30 年代传入我国，开展在植物胚芽的培养上，因其具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用的优点，被广泛应用于生物学及组织学的各个领域。然而，单层细胞培养虽然易于操作、培养条件便于调控，但与人体内环境存在差距；而细胞共培养技术能弥补单层细胞培养的缺陷，有利于构建更接近人体状态的体外生理或病理模型。 细胞共培养又称为复合培养或混合培养，是指将 2 种或2 种以上细胞放在同一培养系统中培养。与单层细胞培养技术相比，细胞共培养技术可以很大程度地模拟体内环境，以便更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用，通过检测不同细胞因子之间的关系，探讨药物的作用机制和可能的作用靶点。细胞共培养技术一直倍受关注，主要用于研究诱导干细胞分化、提高代谢物产量、提高细胞生存能力、维持细胞功能和活性、体外组织的构建等。目前，细胞共培养方法主要包括直接接触共培养、间接接触共培养和三维细胞共培养，3 种方法的选择主要根据共培养细胞的正常形态、研究者的目的以及研究能否方便、顺利进行而决定。 1 直接接触共培养法 直接接触共培养是指把 2 种或 2 种以上细胞放在同一培养体系中，使之直接接触。这种方法适用于体内邻近的组织细胞，主要因为这些细胞在体内可通过通讯连接、封闭连接和锚定连接等方式传递所产生的细胞因子，而直接接触式培养可保留这些连接信息，使培养的细胞更接近体内自然状态；该方法还适用于 2 种生长状态相同的细胞，例如 2 种贴壁细胞或 2 种悬浮细胞。这种方法的优点是操作方便，对培养皿或培养瓶的要求较低，一般常用的细胞支持物即可。该方法主要用于研究细胞间相互作用以及诱导细胞分化。刘尧将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）与人软骨细胞（hACs）从人体分离培养后，接种于丝素蛋白支架上进行直接共培养，通过苏木素 - 伊红（HE）染色技术、Ⅱ型胶原染色技术观察细胞形态，并与在同样支持物下用诱导剂培养的 hBMSCs，以及单纯 hACs 进行比较，发现 hBMSCs 与 hACs直接接触共培养有利于软骨细胞外基质的产生。Watanabe等发现，在与自身骨髓间充质干细胞（BMSCs）的相互接触共培养中，人髓核细胞生物学活性明显提高。还有研究表明，将内皮细胞和神经干细胞直接接触共培养后，在血管内皮生长因子的作用下，内皮细胞可以促进神经干细胞增殖，并有向神经细胞分化的趋势。 临床细胞移植治疗也可以被看作是外源细胞和自身细胞的直接接触共培养，其中间充质干细胞因易获得、易培养、较稳定，具有强大的增殖能力，且不违背伦理道德被广泛用于科研与临床。陈肖等将分离的 BMSCs 接种于创伤弧菌脓毒症模型小鼠，探讨其对创伤弧菌脓毒症肺损伤的作用，发现 BMSC 能降低炎性因子水平并减轻肺损伤。虽然直接接触共培养操作简单，但其难度在于对指标的考察，因为很难用一般的方法将 2 种形态相同的细胞区别开来，目前可以使用形态学方法检测，或者用双标免疫组化技术或原位杂交技术，或用不同的荧光标记，亦可以用 2 种不同标记的抗体或探针进行免疫组化或杂交，以分清 2 种不同的细胞，并可分析 2 种细胞之间的关系。2 间接接触共培养法 2.1 条件培养基共培养法：条件培养基是用培养过一种细胞的培养基培养另一种细胞，2 种细胞不直接接触，而细胞因子可以交流，其优点是可以消除目的细胞对条件细胞的影响，突出条件细胞对目的细胞的作用。此法简便易行，但是时间上的不统一是不可控因素，因此严格来说，这种方法介于单层细胞培养和共培养之间，是单层细胞培养与共培养之间的过渡。宋旆文等［17］利用这种方法观察 BMSCs 条件培养基对神经干细胞（NSCs）分化的影响，在避免了 2 种细胞接触产生作用的情况下，观察到 NSCs 的贴壁分化，肯定了 BMSCs 条件培养基对 NSCs 贴壁分化的积极作用，而不依赖于 BMSCs 本身，为 BMSCs 条件培养基与 NSCs共同移植提供了依据。周凌等以鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM）作为血管生成体内模型，观察到与单层细胞培养相比，人食管癌细胞株 Eca-9706 细胞条件培养基可显著增加人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移以及小管形成。 2.2 “爬片式”共培养法： “爬片式”共培养法是将细胞先接种在处理后的玻片上，待细胞贴壁后，以一定比例放入另一种细胞的培养皿中与其共培养。有研究者用该方法将接种了骨髓单核细胞的玻片或骨片置入提前 24h 接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养，结果显示，成骨细胞对破骨细胞的调控作用显著，诱导的破骨细胞具有噬骨能力，成功建立了共培养模型，用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究。 2.3 嵌入式细胞共培养法（Transwell 小室）：嵌入式共培养法又称“筏式”培养法或 Transwell共培养体系，是指将带有聚碳酯（PC）、聚酯（PET）或胶原包被的聚四氟乙烯（PTFE）膜的 Transwell小室放在相应的培养板上建立的共培养体系。Transwell 小室底部的膜将上下层细胞分开，膜的直径小于3.0μm，一般为 0.4μm，细胞不能自由通过此膜，但细胞因子可以自由通过，两者可通过此膜进行信息交流。嵌入式细胞共培养法是目前应用最多的方法。这种间接共培养法可用于各种生长状态的细胞，其优点是便于分离 2 种细胞，可更好地观察其各自的细胞状态变化，以探讨一种细胞对另一种细胞的作用。Cao 等［20］采用 Transwell 小室共培养处理过的内皮细胞和上皮细胞，探讨了多壁碳纳米管棕榈酸在心血管疾病中的作用。张明通过分离、培养人纤维环（AF）细胞与 BMSCs，分别吸取第 3 代 AF 细胞和 BMSCs，按 1：1 比例分别植于 Transwell 小室共培养系统中，下室植入 BMSCs，上室植入 AF 细胞，以建立 2 种细胞间接共培养模型，从而探讨了共培养体系对 AF 细胞增殖和细胞外基质合成的影响，以及 BMSCs 是否具有向 AF 细胞分化的能力。Holownia 等将烟雾处理过的单核细胞株 THP-1 细胞置于 Transwell 小室上层，肺泡上皮细胞株 A549 细胞置于小室下层，共培养24h，探讨香烟烟雾对共培养条件下 A549 和 THP-1 细胞的影响，从而得出在暴露于烟雾条件下，THP-1 细胞对 A549细胞可能有保护作用的结论。 2.4 其他间接接触共培养方法： 在共培养过程中，研究者也可以用现有的实验设备制作简易的共培养装置。魏会秒利用自制 48 孔培养板，以 6 孔为一个单元，先将大鼠多器官原代细胞单独培养，采用在相邻两孔壁上打孔的方法使 6 孔细胞培养基共享，从而构成间接共培养体系，建立了大鼠多器官原代细胞共培养模型，并以各原代细胞单独培养作为对照，探讨了不同刺激物对不同靶器官的毒性作用。李华等采用 6 孔细胞培养板和 6 孔悬挂式培养皿建立共培养模型，将人脐带间充质干细胞及人肝细胞株 LO2 细胞共培养，发现在此条件下，人脐带间充质干细胞可以分化为肝样细胞。 感谢分享经验
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