动态浊度法定量检测乳糖一水合物中细菌内毒素的含量

       动态浊度法定量检测乳糖一水合物中细菌内毒素的含量 刘晋 1，王芳芳 2，冯宇 3*，杨喆 3，秦焕甲 3，殷鑫 3 (1. 聊城市食品药品检验检测中心，聊城 252000；2. 聊城市食品药品检验检测中心，聊城 252000； 3. 科德角国际生物医学科技（北京）有限公司，北京 100068） 摘要　目的：应用美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）的动态浊度法，定量检测乳糖一水合物中细菌内毒素。方法：依据 2015 年版《中华人民共和国药典》 的要求，应用Pyros Kinetix® Flex（PKF）细菌内毒素定量检测系统，使用葡聚糖抑制缓冲液稀释溶解LAL，建立细菌内毒素的标准曲线并确定稀释倍数，通过测定供试品溶液中外加内毒素的回收率进行干扰试验，并定量测定样品中的细菌内毒素含量。Pyros® EQS 软件自动绘制并出具标准曲线，计算溶液中内毒素的含量。 结果：内毒素检测标准曲线浓度线性范围为 0.001~0.032 EU·mL-1（r=-0.9854），标准曲线回归方程为 logT=-0.200logC+2.943；供试品在稀释 100、300、500 倍时均对试验无干扰作用，细菌内毒素回收率在50%~200%之间；4 批样品的内毒素定量测定结果符合规定。 结论：在PyrosKinetix®Flex（PKF）细菌内毒素定量检测系统平台，使用 LAL 建立的动态浊度法，可用于乳糖一水合物的细菌内毒素定量检测。LAL 有更高的灵敏度，葡聚糖抑制缓冲液可有效阻止由(1 → 3)-β-D- 葡聚糖引起的干扰，提高试验的成功率，符合数据完整性的要求。 关键词：葡聚糖抑制缓冲液；乳糖一水合物；动态浊度法；细菌内毒素；干扰试验；美洲鲎试剂；有效稀释倍数；灵敏度 Content determination of bacterial endotoxin in lactose monohydrate by kinetic turbidimetric method LIU Jin1，WAHG Fang-fang2，FENG Yu2，YANG Zhe3，QIN Huan-jia3，YIN Xin3 (1. Liaocheng Food and Drug Testing and Testing Center，Liaocheng 252000，China;2.Liaocheng Food and Drug Testing and Testing Center，Liaocheng 252000，China；3.Coastal-Times International BioMedical Technologies（Beijing）Co.，Ltd.，Beijing 100068，China） Abstract Objective：To develope a kinetic turbidimetric method with Limulus Amebocyte Lysate（LAL) to quantify bacterial endotoxin in lactose monohydrate. Methods：According to the requirements in Chapter 1143 Bacterial Endotoxin Test in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition，by using Pyros Kinetix® Flex（PKF）bacterial endotoxin quantitative detection system and LAL dissolved in glucan inhibitory buffer，a standard curve for bacterial endotoxin was established and the dilution factor was determined.The interference test was performed by measuring recovery rate of endotoxin added in the test solution，and bacterial endotoxin in the sample was quantitatively determined.Pyros® EQS software automatically produced a calibration curve to calculate the absolute content of endotoxin in each solution. Results：Concentration linear ranges of endotoxin detection calibration curve was 0.001-0.032 EU·mL-1（r=-0.985 4）with recovery rate of 50%-200%，and no interference was observed for test samples diluted 100-500 times.Results of quantitative determination of endotoxin in four batches of samples met the requirements.Conclusion：On the platform of PKF bacterial endotoxin quantitative detection system，the kinetic turbidimetric endotoxin method using LAL can be used for bacterial endotoxin detection of lactose monohydrate. Glucan inhibitory buffer effectively prevented the interference caused by（1 → 3）-β-D-glucan，improved the test success rate，sensitivity and accuracy of detection.the experiment met data integrity requirements. Keywords：glucashield beta glucan inhibiting buffer；lactose monohydrate；kinetic turbidimetric method；bacterial endotoxin；interference test；Limulus Amebocyte Lysate（LAL）；maximum valid dilution；highest sensitivity 注射用福沙匹坦二甲葡胺是用于抑制肿瘤所致呕吐反应的药物，以静脉注射的方式给药。由于铂类、等多种抗肿瘤药物在使用过程中会产生严重的呕吐反应，而急性剧烈的、呕吐可能导致患者脱水、电解质紊乱、营养不良，严重者可能因消化道黏膜损伤而出血、感染甚至死亡，严重影响效果，因而止吐药是抗重要的辅助治疗药物。福沙匹坦二甲葡胺注射剂与其他止吐药联用，可用于防治中等催吐及大剂量催吐的肿瘤（包括大剂量）初始和反复用药引起的急性和迟后的和呕吐［3］。 乳糖一水合物是一种白色或类白色的晶体状粉末，缓慢溶于水，几乎不溶于乙醇（96%），是注射用福沙匹坦二甲葡胺注射液的一类重要辅料。对乳糖一水合物进行细菌内毒素检测，是对药物生产源头的质量把关与控制，可使药物的质量更有保证，故在福沙匹坦二甲葡胺注射剂生产的质量控制中具有重要意义［2］。目前国内多采用凝胶法对乳糖一水合物进行细菌内毒素检测，质量标准规定其限值应小于0.005 EU·mg-1。本研究参照 2015 年版《中华人民共和国药典》［1］中的动态浊度法，对乳糖一水合物中的细菌内毒素定量检测方法进行开发，试图找到一种干扰影响小、灵敏度高、更为准确的定量检测方法。 1　仪器与试药 Pyros Kinetix® Flex 96（PKF 96）细菌内毒素定量检测系统（Associates of Cape Cod 公司)。Pyros® EQS 软件（搭配 PFK 细菌内毒素定量检测系统的专用软件，Associates of Cape Cod.Inc.） 乳糖 一 水 合 物（DMV Fonterra Excipients GmbH &Co.KG 公 司，Lactohale® 200 Milled lactose monohydrate，批号：Lactose-1031D73、Lactose-1031D74、Lactose-1031D75、Lactose-1031D76）。 动 态 浊 度 法 美 洲 鲎 试 剂（LAL，批 号 518-11-903-T，灵敏度λ=0.001 EU·mL-1，规格 5 mL·瓶 -1）；细菌内毒素工作标准品（control standard endotoxin，CSE；批号 162）；无热原水（LAL reagent water，LRW批 号 AD，规 格 50 mL· 瓶 -1）；葡 聚 糖 抑制缓冲液（批号 1207063）；硼硅酸盐玻璃反应试管（8 mm×75 mm）；硼硅酸盐玻璃稀释试管（12 mm× 75 mm）。以上所有试剂与耗材均来自 Associates of Cape Cod 公司。 2　方法与结果 2.1 细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析 用葡聚糖抑制缓冲液复溶 LAL，用无热原水稀释 CSE，使 其 最 终 浓 度 分 别 为 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 EU·mL-1。各取0.1 mL，分 别 加到预先加有 0.1 mL 鲎试剂的反应试管内，混合均匀，将反应试管插入设置好的 PKF 细菌内毒素定量检测系统中，每一浓度重复 3 管，同时做 2 管阴性对照。当阴性对照的吸收度或透光率小于标准曲线点的检测值，反应时间大于标准曲线点的反应时间时，将全部数据进行线性回归分析。Pyros® EQS 软件自动出具标准曲线回归报告，以到达反应终点所需时间的对数值对细菌内毒素浓度的对数值绘制标准曲线：logT=-0.200logC+2.943 r=0.985 4 标准曲线中 CSE 的浓度为 0.001 EU·mL-1，此浓度点的反应时间小于阴性对照的反应时间［1］，故标准曲线成立。细菌内毒素标准曲线及可靠性分析结果见表 1。 1细菌内毒素标准曲线及可靠性分析 Tab. 1 Standard curves of bacterial endotoxinand reliability analysis 标准曲线中细菌内毒素浓度（standard curves concentration）/（EU·mL-1） CV/% 配置值（preparation value） 实测值（measured value） 0.032 0.02740 2.537 0.016 0.01603 2.666 0.008 0.008968 1.259 0.004 0.005138 7.383 0.002 0.002325 15.951 0.001 0.00073 27.251 2.2 有效稀释倍数（MVD）的确定 取乳糖一水合物样品粉末 0.5 g，用 5 mL 无热原水溶解并稀释，制得终浓度（C）为 100 mg·mL-1 的 溶液。，按细菌内毒素限值（L）0.005 EU·mg-1，标准曲线浓度（λ）0.001 EU·mL-1，计算乳糖一水合物样品的 MVD：MVD=100 mg·mL-1×0.005 EU·mg -1/0.000 1EU·mL-1=500 倍 2.3 干扰试验 根据标准曲线内毒素浓度的设置，选择标准曲线中点 0.004 EU·mL-1 作为加标内毒素浓度（λm）。取 批号 Lactose-1031D73、Lactose-1031D74、Lactose-1031D75、Lactose-1031D76 的乳糖一水合物粉末 0.5 g，分别溶于 5 mL 无热原水中，静置，待样品溶解后再分别稀释至 100、300、500 倍，作为供试品溶液，将0.1 mL 0.004 EU·mL-1（λm）浓度的 CSE 溶液分别加入到 0.9 mL 100、300、500 倍的供试品溶液中，制备供试品阳性对照溶液。分别取阴性对照、供试品溶液、供试品阳性对照溶液各 0.1 mL，加到预先加有 0.1mL LAL 的反应管内，混合均匀，将反应试管插入设置好的 PKF 细菌内毒素定量检测系统中进行测定，各反应均做 2 个平行复孔。测定结束后，Pyros® EQS 软件自动出具试验数据及报告，结果见表 2。 2干扰试验及供试品细菌内毒素含量测定结果 Tab. 2 Interference test and content determination of bacterial endotoxin in samples 批号 （lot No.） 稀释倍数 （dilution factor） 细菌内毒素浓度（concentration）/（EU·mL-1） 回收率 （recovery）/% 限值 （limit） 加标值 （spiked） 平均值 （mean） 阳性对照 （positive control） Lactose-1031D73 1∶100 0.004 0.002 671 94.0 0.5 1∶300 0.004 0.003 344 104.0 0.5 1∶500 0.004 0.002 787 102.0 0.5 Lactose-1031D74 1∶100 0.004 0.003 422 89.0 0.5 1∶300 0.004 0.002 727 93.0 0.5 1∶500 0.004 0.003 052 91 0.5 Lactose-1031D75 1∶100 0.004 0.003 241 107.0 0.5 1∶300 0.004 0.004 064 99.0 0.5 1∶500 0.004 0.004 683 101.0 0.5 Lactose-1031D76 1∶100 0.004 0.002 413 116.0 0.5 1∶300 0.004 0.004 273 105.0 0.5 1∶500 0.004 0.003 484 110.0 0.5 根据标准曲线计算不同稀释倍数下供试品溶液中细菌内毒素的含量及回收率，Pyros® EQS 软件的数 据与报告系统中会自动出具报告和细菌内毒素检测结果。干扰试验中各批次的供试品，经 100、300、500倍稀释后，其回收率在 50%~200% 范围内，符合要求［1］，可以认为供试品溶液中成分不存在干扰作用。 2.4 供试品定量检查 供试品检查同“2.3”项下方法，实验结果参见表2，结果 4 批样品细菌内毒素含量均符合规定。 3　讨论 3.1 方法开发的意义 本试验用动态浊度法检测福沙匹坦二甲葡胺注射液的辅料——乳糖一水合物中的细菌内毒素含量。动态浊度法是常用的细菌内毒素定量检测方法，通过检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸收度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度来定量测定样品中内毒素的含量。该方法操作简单、快速、灵敏度高、检测范围宽。动态浊度法的干扰试验中，以样品中外加内毒素的回收率进行判断，若回收率在50%~200% 之间，可认为样品溶液对试验无干扰［5-9］。该方案相对于传统的凝胶法，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、节约时间等优点［6，12］，能够更好地满足药品质量控制的要求。该试验的另外一个重要意义，是选择对辅料进行检测。对辅料乳糖一水合物进行细菌内毒素定量检测是对福沙匹坦二甲葡胺注射液药品的源头进行精准的质量把控，是更高级别的质量控制要求［2］。 3.2 葡聚糖抑制缓冲液可以解决葡聚糖干扰问题 本试验使用葡聚糖抑制缓冲液来复溶 LAL，该缓冲液在内毒素试验中可以阻断（1 → 3）-β-D-葡聚糖的干扰。当供试品溶液中同时存在细菌内毒素与（1 → 3）-β-D- 葡 聚 糖 时，会产生假阳性反应，另外，和不存在（1 → 3）-β-D- 葡聚糖相比，凝胶反应会更迅速、更剧烈［13］。假阳性反应与 （1 → 3）-β-D- 葡聚糖的存在有关，原因是 LAL 中葡聚糖敏感因子（G 因子）被激活，使得供试品中细菌内毒素含量虽然并未超过规定限值，但检查呈现阳性，被误判为不合格［6，13］。如不确定某样品是否受到（1 → 3）-β-D- 葡聚糖干扰，在针对同一样品的测试中，将非葡聚糖抑制缓冲液复溶的 LAL 检测的细菌内毒素水平与葡聚糖抑制缓冲液复溶 LAL 检测的细菌内毒素水平进行比较，如果使用葡聚糖抑制缓冲液复溶的报告中细菌内毒素含量明显较低，则说明样品可能有（1 → 3）-β-D- 葡聚糖干扰。葡聚糖抑制缓冲液可有效阻止由高达 100 ng·mL-1 的葡聚糖浓度引起的干扰，使鲎试剂对于供试品的抗干扰能力大大增强。 3.3 高灵敏度鲎试剂可拓宽有效稀释倍数 用 凝 胶 法 测 试 该 样 品 时，采 用 灵 敏 度 为 0.03EU·mL-1 的凝胶法鲎试剂进行试验，乳糖一水合物样 品 的 有 效 稀 释 倍 数：MVD=CL/λ=100 mg·mL-1×0.005 EU·mg-1/0.03 EU·mL-1=16 倍，供试品对试验干扰明显，由于试剂灵敏度的限制，样品无法稀释更大的倍数来消除干扰。LAL 的灵敏度能达到 0.001 EU·mL-1，使得供试品的有效稀释倍数扩增至 500 倍，动态浊度法的干扰试验，以样品中外加内毒素的回收率进行判断，在稀释倍数 为 100、300 和 500 倍 时 均 有 的 回 收率，回收率 在 50%~200% 之 间，可认为样品溶液对试验无干扰。LAL的高灵敏度，可以增大样品的 有效稀释倍数，降低样品对内毒素反应带来的干扰［5，13］。 3.4 符合法规与数据完整性要求 PKF 细菌内毒素定量检测系统与 Pyros® EQS 软件严格遵循联邦法典 21 CFR Part 11 标准，同时符合 《中国人民共和国药典》、USP、JP、EP 等多国法规的规定与要求，软件具备三级管理权限、审计追踪及电子签名功能，满足试验的数据完整性要求。本文采用动态浊度法对福沙匹坦二甲葡胺注射液中的辅料乳糖一水合物进行细菌内毒素定量检测，试验结果表明，样品进行 100 倍、300 倍、500 倍稀释时均对试验无干扰，多批样品检查结果符合规定。因此，在 PKF 细菌内毒素定量检测系统上开发动态浊度法来定量检测福沙匹坦二甲葡胺注射液的辅料乳糖一水合物中细菌内毒素含量的方法是可行的。 参考文献 [1] 中华人民共和国药典 2015 年版 . 四部［S］.2015：154ChP 2015.Vol Ⅳ［S］．2015：154 [2] 李薇，刘肃，何华红，等 . 原料药的细菌内毒素检查法可行性研究［J］. 中国药房，2010，21（17）：1592 LI W，LIU S，HE HH，et al．Study on the practicability of bacterial endotoxins test for adenosine disodium triphosphate raw material［J］．China Pharm，2010，21（17）：1592 [3] 章亚兵，许雷鸣 . 注射用福沙匹坦二甲葡胺中细菌内毒素检查法的建立［J］. 安徽医药，2013，17（8）：1298 ZHANG YB，XU LM．Determination of bacterial endotoxin of fosaprepitant dimeglumine for injection［J］．Anhui Med Pharm J，2013，17（8）：1298 [4] 张广琴，沈剑，黄幸芳，等 . 动态浊度法定量检测注射液中细菌内毒素［J］. 中国药业，2006，15（16）：25 ZHANG GQ，SHEN J，HUANG XF，et al．Quantitative detection of bacterial endotoxin in compound sodium chloride injection by dynamic turbidity method［J］．China Pharm，2006，15（16）：25 [5] 祝清芬，魏霞 . 动态浊度法测定注射液中细菌内毒素的含量［J］. 中国药房，2011，22（1）：54 ZHU QF，WEI X．Content determination of bacterial endotoxin in docetaxel injection by kinetic turbidimetric method［J］．China Pharm，2011，22（1）：54 [6] 肖鲲，李建华，吴文静，等 . 动态浊度法检测细菌内毒素试验假阳性结果原因分析［J］. 中国输血杂志，2012，25（3）：274 XIAO K，LI JH，WU WJ，et al．Analysis of the causes of false positive results of bacterial endotoxin test by dynamic turbidimetry［J］．Chin J Blood Transfus，2012，25（3）：274 [7] 肖贵南 . 注射液细菌内毒素的动态浊度法定量研究［J］. 中国药理学通报，2003，19（4）：435 XIAO GN．Quantitative study of bacterial endotoxin in cisplatin injection by dynamic turbidimetry［J］．Chin Pharmacol Bull，2003，19（4）：435 [8] 苑庆华，芮菁，华晓东，等 . 动态浊度法定量检测注射液中内毒素研究［J］. 中国药学杂志，2003，38（12）：952 YUAN QH，RUI J，HUA XD，et al．Measurement of endotoxin in tinidazole injection using the kinetic-turbidimetric technique［J］．Chin Pharm J，2003，38（12）：952 [9] 李荣，吴玲 . 动态浊度法检测乳酸左中的细菌内毒素［J］. 中国药房，2012，23（9）：837 LI R，WU L．Determination of bacterial endotoxin for levofloxacin lactate/sodium chloride injection by kinetic turbidimetric limulus test［J］．China Pharm，2012，23（9）：837 [10] 张秀萍，赵海山，苑庆华，等 . 动态浊度法定量检测注射液中细菌内毒素［J］. 药物分析杂志，2000，20（4）：272 ZHANG XP，ZHAO HS，YUAN QH，et al．Quantitative detection of bacterial endotoxin in Xuesaitong injection by dynamic turbidity method［J］．Chin J Pharm Anal，2000，20（4）：272 [11] 祝清芬，国明，魏霞，等 . 注射液动态浊度法细菌内毒素检查方法研究［J］. 中国新药杂志，2013，22（3）：355 ZHU QF，GUO M，WEI X，et al．Detection of bacterial endotoxin in milrinone injection by the method of kinetic turbidimetric limulus test［J］．Chin J New Drugs，2013，22（3）：355 [12] 李树馀 . 注射用顺苯磺酸阿曲库铵细菌内毒素检测动态浊度法的研究［J］. 药物分析杂志，2014，34（2）：340 LI SY．Study on bacterial endotoxin test of cisatracurium besilate for injection using the dynamic turbidity method［J］．Chin J Pharm Anal，2014，34（2）：340 [13] 何进，高军，陈金旺 . 凝胶法细菌内毒素检查的干扰因素及消除［J］. 中国药师，2010，13（2）：284 HE J，GAO J，CHEN JW．Interference factors and elimination of bacterial endotoxin test by gel method［J］．China Pharm，2010，13（2）：284