荧光显微镜中的多波长落射照明

       荧光是一种过程，在该过程中，已吸收光（光子）的物质发出的辐射的波长（颜色）长于被吸收的光的波长，并且该发光在激发停止后立即停止。这种现象是荧光显微镜及其应用的基本要素。
　　除了在光学显微镜中荧光的“经典”激发之外，今天还可以通过共焦激光扫描显微镜的现代技术，通过用两个或多个光子的波长长于所发射的光子的激发来获得相同的发射效果。
　　荧光要么以生物学和/或无机结构的自发荧光形式出现，要么以特殊染料（荧光染料，荧光标记）处理样品后以所谓的二次荧光的形式出现。为了在显微镜中执行荧光，必须满足以下要求：的能源（高压汞弧灯，卤素灯等），足够的透射滤光片系统（滤光片），可以地选择激发光和发出的辐射，最后但并非最不重要的是，适用于荧光的光学零件和装备，例如集光镜，照明器，分束器，物镜，管形镜和目镜。
　　与今天的情况相比，荧光显微镜是使用透射光和暗场显微镜。这是由于当时的应用范围有限。但是随着其对组织学，细胞学，分子生物学和免疫诊断的重要性日益提高，对照明和观察技术的根本改进的需求也越来越大。这是入射光荧光显微镜检查的诞生时间。
　　在近40年的应用和开发过程中，该技术已成为生物学，医学，科学和工业领域常规和研究工作的基本工具之一。Ploem的研究工作及其作为趋势设定者的功能以及Leitz的前瞻策略尤其决定了入射光荧光显微镜的进展。Leica Wetzlar在开发所需的光学仪器时。
　　在本文稿中按时间顺序描述了这一发展过程。荧光显微镜技术的摘要表提供了有关显微镜，物镜，荧光染料，光源和过滤器系统的相关信息，涉及应用领域和涉及此方法的方法。
　　荧光是一种分子现象，其中物质在很短的时间内吸收光（激发）并辐射较长波长的光（发射）。当荧光染料吸收光时，会吸收光子形式的能量，从而将电子激发到更高的能量状态。光子的吸收过程非常迅速，随后立即返回到较低的能量状态，然后伴随着光子的发射，如果在可见范围内发射光，则可以观察到。
　　这种短暂的持续时间（纳秒）将其与其他形式的发光（例如磷光）区分开来。激发峰和发射峰之间的波长差称为斯托克斯位移。斯托克斯位移大的荧光染料很容易激发并在荧光显微镜下观察其发射。在透射光照明下，小的斯托克斯位移可能使得无法在其激发峰处照亮荧光染料，而无法在其发射峰处观察荧光色。
　　共聚焦激光扫描荧光显微镜可以用波长比发射光更长的光子进行双光子激发。然后，电子以两个所需能量的一半的光子进入激发态，同时到达。在大多数情况下，电子在下降到基态之前，会以与正常单光子激发相同的激发态结束。同样，发出的荧光与正常单光子激发发出的荧光相似。
　　许多非有机和有机分子均显示荧光发射，尤其是在使用高能辐射激发的情况下。当植物或动物组织被激发与UV -light非常经常发蓝荧光发射，观察到被称为初级荧光，或自体荧光。天然存在的物质通常具有非常宽的激发和发射光谱。随着分子生物学的发展，研究已经集中在具有明亮荧光的特殊染料上，以区别于可能的自发荧光。用于选择性地对生物学上重要的分子进行染色的染料称为荧光染料。当与抗体或核酸偶联时，它们被称为荧光标记或探针。如今，荧光染料在光谱的紫色，蓝色，绿色，橙色，红色和近红外区域具有峰值发射。可以用橙色和红色光激发荧光染料，并用光电倍增管或CCD检测红色和红外荧光-相机的荧光显微镜技术已经超出了视觉范围。荧光染料的激发和发射可能会随着细胞环境的变化而变化。之所以选择某些染料，是因为它们的激发或发射光谱会随着细胞内介质中某些离子的浓度（例如钙，钠和pH值）的变化而发生变化。
　　回顾荧光显微镜的历史，读者可以参考Kasten 。落射照明（垂直入射的激发光）已经被Policard和Paillot使用。几个仪器由Leitz公司（徕卡），博士伦，赖克特和蔡司，将其部分地基于由Ellinger和Hirt的，歌手和梅勒和Pick。Haitinger描述了早期的Leitz（Leica）荧光落射照明系统。有关落射照明荧光显微镜演变的更多详细信息，请参阅Rost以及用于入射光荧光显微镜的早期应用到豪瑟。
　　落射照明荧光显微镜的主要贡献是Brumberg和Krylova引入了用于紫外光入射照明的双色镜。落射照明具有一定的光学优势，因为与透射照明不同，聚光镜和物镜具有独立的光轴，必须对准。物镜既用作聚光镜又用作聚光镜，避免了所有对准问题。使用二色性分光镜将激发光中的荧光发射分离比使用透射光荧光显微镜要容易得多。但是，这些可能性并未使工业显微镜制造商普遍接受落射照明作为常规荧光显微镜。造成这种现象的主要原因可能是在大多数荧光显微镜应用中，透射光暗场UV激发已经产生了出色的结果。用紫外线落射照明代替它不会有明显的优势。直到六十年代后期，利用暗场聚光镜使用透射光仍然是工业标准。
　　然而，对分子生物学的快速增长的兴趣导致了许多用于检测细胞中重要大分子的（单克隆）抗体的发展。为了研究几种大分子在细胞器中的详细形态学位置，越来越多地使用具有不同颜色的荧光标记。传统上用于荧光显微镜的紫外线激发并非同时检测细胞中的多种荧光染料。
　　大约在1962年，Ploem开始与Schott合作开发分色镜，用于反射蓝光和绿光，用于落射照明的荧光显微镜。在他的次交流[1965]和发表关于用窄带蓝光和绿光进行落射照明时时，他还不知道Brumberg和Krylova用入射光进行紫外线激发的二向色分束器的发展。Leitz公司也没有，他从中获得了带有中性分束器的“ Opak”落射照明器。该照明器必须进行修改，以在入射光路径中包含一个滑块，该滑块包含四个分别用于UV的二向色分束器，紫色，蓝色和绿色的激发光。阿姆斯特丹大学开发的该设备允许在入射光路上轻松交换不同的二向色分束器（图1a）。激发光的波长因此可以容易且快速地改变。

　　图1a：荧光多波长落射照明器，在滑块中安装了四个二向色分束器，用于紫外线，紫色，蓝色和绿色激发光的入射照明。在阿姆斯特丹大学建造（普隆，1965年）。

　　图1b：Leitz原型（未商业化）多波长落射照明器，其中有四个安装在滑块上的二向色分束器（Ploem，1967）。

　　图1c：带有四个可更换滤光片立方体（块）的Leitz落射照明器（Kraft，1972年）。
　　很快就清楚了，用窄带蓝光和绿光激发为检测广泛使用的免疫荧光标记异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）打开了可能性。蓝色和绿色激发的使用也使组织成分的自发荧光最小化，这是常规的紫外线透射照明所不希望的效果。FITC现在可以用窄带蓝光（使用半宽为16 nm的带隙滤光片）激发，接近490 nm处的激发（长波长蓝光），并且清楚地观察到520 nm处的绿色荧光峰发射。组织成分的自发荧光被最小化（图2a和b），从而导致高图像对比度。的激发FITC接近其激发启用这样的高效激发，即使是汞高压弧光灯，具有在蓝色波长范围内没有很强的发射峰，也可以使用。此外，绿色反射二向色镜的落射照明实现了用546 nm的强汞发射线激发Feulgen-pararos的激发（图3a和b）。

　　图2a：标记有免疫标签（FITC）的组织细胞被宽带紫外线激发照射。注意蓝色自发荧光的组织结构。

　　图2b：使用窄带蓝色（490 nm）光通过落射照明照射的带有FITC标签的相同组织和相同免疫染色。注意增加的图像对比度（Ploem，1967）。

　　图3a：肝组织。细胞核用Feulgen-pararosanilin染色以检测DNA，并用透射的绿光可视化。该污渍被称为吸收性污渍，但不发荧光。原子核上的一个被入射的窄带绿光（546 nm）照射，导致发出红色荧光。

　　图3b：肝组织。细胞核用Feulgen-pararos染色以检测DNA。落射照明采用窄带绿光（546 nm）和用于反射绿光的二向色分束器。可能是用绿光激发显微镜的个例子（Ploem，1965）。注意较大的图像对比度。
　　在他的第二本关于多波长落射照明器的出版物中，描述了带有四个二向色性光束散射体的Leitz原型（图1b），Ploem可以肯定Brumberg和Krylova的贡献。在那个时期，俄罗斯研究的不可及性，以及在俄罗斯或东德，没有任何主要的落射荧光显微镜工业发展，这就是莱茨较早就不知道这种发展的原因。用紫外线照射落射照明的可能性虽然对一些应用有用，但并不是Leitz进行新技术开发的动力，因为它们已经具有出色的透射暗场紫外线激发可用。然而，常规免疫荧光显微镜在医学诊断和分子生物学研究中在世界范围内的日益广泛使用可能受益于使用蓝光和绿光的窄带激发进行落射照明的新可能性。由于可以使用标准的高压汞弧灯，所以这似乎是一个实际的建议。

　　图4：用于荧光显微镜的完整Leitz（Leica）滤光片立方体（块），包含：激发滤光片，二向色分束器和发射（阻挡）滤光片。
　　随后，Leitz开发了一种新颖的多波长荧光落射照明器（Leitz PLOEMOPAK），该照明器带有四个旋转的二向色分光镜，分别用于紫外线，紫光，蓝光和绿光。在连续几代的Leitz照明器（包含四个二向色分束器）中，添加了滤光镜和用于激发滤光镜的旋转转塔。最终，卡夫（Kraft）包含多组激发滤光片，二向色分束器和势垒或发射滤光片的组合，这些滤光片一起安装在滤光块（也称为滤光块）中（图4）。由于该照明器允许滤光片立方体迅速变成光路，因此对同一组织切片的多波长照明成为一个实际的建议。此外，用户可以更换照明器中的四个滤镜立方体（图1c）。可以组装不同的四个滤镜立方体，从许多滤镜立方体中进行选择，这些滤镜立方体包含为不同应用而开发的激发，势垒滤镜和二向色分束镜的组合。根据Ploem的建议，Leitz还生产了带有落射照明的倒置显微镜（图5a和b）。

　　图5a：具有多波长落射照明器的Leica倒置荧光显微镜。

　　图5b：经过荧光细胞毒性试验的带有人类淋巴细胞的Terasaki®塑料托盘用于移植研究。用倒置显微镜进行落射照明。

　　图5c：Leitz（Leica）电动落射照明器，带有八个滤光块（块）。
　　Leitz（Leica）滤镜立方体系统是如此高效，以至于39年后的今天，大多数显微镜制造商仍在使用类似类型的滤镜立方体进行多波长荧光显微镜检查。这项开发最终导致Leica研发出了自动多波长荧光落射照明器，该照明器可容纳用于各种波长范围的八个滤光块（图5c）。当在滤镜立方体之间切换时，由于采用了0像素移位技术，因此可以避免在计算机显示器上发生像素移位或将其保持在35mm胶片的分辨率之下。这种照明器现在用于染色体研究中的荧光原位杂交方法（FISH）。
　　Ploem，范德Ploeg和Ploem和奈恩和Ploem进一步探讨了有许多生物医学应用待开发的过滤器的组合。这是与Schott和Leitz合作完成的。Rygaard和Olson开发了一种新型的短波高透射干涉滤光片，该滤光片对蓝光具有很高的透射率，并且对于超过490 nm的波长具有很强的截止能力。
　　Ploem将此SP滤光片与Schott的1 mm GG 455滤光片结合使用，从而阻止了UV激发，并建议Balzers开发一种类似的滤光片（SP 560 = KP 560）进行绿光激发，并开发一种滤光片进行激发。用紫光（LP 425 = KP 425）。后一种过滤器被应用于神经递质的研究。在图6a和b中，可以观察到蓝色荧光。

　　图6a：大鼠小肠系膜，周围是蓝色荧光肾上腺素能（CA）神经丛和黄色荧光肥大细胞（5-HT）。甲醛诱导的CA和5-HT荧光团的神经递质荧光。

　　图6b：与图6a相同的组织和染色：使用窄带紫罗兰色激发光（LP 3mmGG 400和SP（KP）425干涉滤光片），分色镜495 nm反射紫光的落射照明光和LP 460 nm的屏障滤光片。这个过滤器立方体允许观察到蓝色荧光的肾上腺素能神经纤维，与黄色荧光的肥大细胞明显不同（Ploem，1971）。
　　从光学工业侧，这些发展早期贡献和评论由牛皮纸，沃尔特，特普和赫尔佐格。
　　在落射照明荧光显微镜中使用的主要滤光片的类型如下：（a）在德国文献中称为KP滤光片的主要激发滤光片LP（长通）和SP（短通片），以及（b）辅助滤光片例如屏障过滤器和发射过滤器。后者也被描述为荧光选择滤光片。例如，这些用于限制观察到FITC在520 nm处的峰值荧光。Reichman对荧光显微镜滤光片进行了近期的广泛综述。
　　Cormane证明荧光标记FITC的窄带蓝光落射照明在人类皮肤疾病的免疫荧光研究中提供了的对比。用紫外线引起的透射光激发引起皮肤中弹性纤维的这种强烈的自发荧光，从而严重阻碍了荧光抗体的可视化。
　　Leitz在落射照明荧光显微镜方面的开创性工作是在70年代发生的，与此同时，免疫荧光和其他分子生物学方法（例如FISH）在医学诊断和研究中的应用也在增加。Hijmans等。是个证明对于某些类型的免疫球蛋白的在细胞中的选择性检测新的Leitz多波长激发落射照明的有用性，使用具有绿色荧光缀合的抗体FITC和红色荧光TRITC。他们应用了蓝光和绿光两种波长的激发方法以及FITC峰值荧光的选择由发射滤光片在520 nm处发射（图7）。Brandtzaeg和Klein等。在使用Leitz落射照明器的两波长激发下，在鉴定具有免疫学意义的重要细胞类型方面取得了类似的发现。在带有“玫瑰红”形成的血液染色中，使用紫外线和绿光的两个波长激发方法可以显示单个核细胞周围的红细胞（图8）。

　　图7：用抗κTRITC缀合物和抗IgG FITC缀合物染色的骨髓细胞。用窄带绿色和蓝色光进行落射照明，导致包含TRITC的细胞呈现红色荧光，而包含FITC的细胞呈现绿色荧光。一些单元格同时包含FITC和TRITC。

　　图8：人血细胞“玫瑰红”的形成。使用紫外线的落射照明将红细胞染上蓝色荧光染料二苯乙烯。绿光激发后，淋巴细胞被橙红色染料曙红染色（1965年）。
　　在落射照明中，使用二向色分束镜将入射光偏转到样品上。二向色镜的光谱特性经过设计，使得只有所需的激发波长才能通过物镜向下偏转到样品上，而不需要的波长则由二向色镜透射并收集在光阱中在二向色镜后面。消除这种不需要的激发光会导致杂散光的显着减少，从而改善图像对比度。双色镜将所需的（短波长）激发光通过物镜偏转到样品上，但对较长的荧光波长透明。抑制滤光片（阻挡滤光片）吸收（或反射）从样品和物镜的镜片表面反射的激发光，但对荧光高度透明，因此可以到达目镜。落射照明的效率与物镜数值孔径（NA）的四次方相关，该物镜首先在落射照明中用作聚光镜，然后在聚光镜中观察。在批多波长落射照明器时，只有具有高NA（0.95，1.30）的高功率物镜（x70，x100）可用。遵循Ploem的建议，莱茨是产生像的1.30的NA（图9）的油浸×40的物镜中等放大倍率物镜的制造商。这种新型物镜，特别是为落射照明荧光显微镜设计的，可产生非常明亮的图像，从而在常规荧光显微照相中可实现较短的曝光时间。

　　图9：Leitz（Leica）早期（1967）原型（“ Versuchs”）油浸物镜x40，其NA 1.30被开发用于荧光落射照明技术的实验。
　　落射照明荧光显微镜中的一个问题是用光源的图像填充物镜的入射光瞳。通常将光源放大8倍左右。这与各种高压汞灯和氙气灯的电弧大小不同有关。此外，物镜的入射光瞳变化很大，例如，对于x100，NA 0.90的物镜，为3.6mm；对于x10，NA 0.30的物镜，为12mm。此外，如果仅弧的一部分可以进入入瞳，则获得的荧光强度将降低。最近Schönenborn报道了徕卡DM R（HCS）显微镜。现在已经设计了落射照明的路径，以允许照明光路针对不同应用所使用的特定光源进行单独调整。假设在入射光路上有Koehler照明，照明光学系统和收集器的组合将使物镜的入射光瞳中的光源成像。对于给定的物镜，光源放大倍数的选择直接取决于其几何尺寸。卤素灯的调整应该非常好，因为灯丝的线圈会对灯丝失调造成的敏感性。那么建议使用相对较低的放大倍数。
　　在某些应用中，在DM R（HCS）显微镜中，荧光强度可以提高1.8倍，而在紫外线范围内的工业应用中甚至可以提高3.5倍。新型特殊用途的高透射率玻璃经彩色校正的六透镜集光器可支持紫外线范围的增加。对于Leica DM R（HCS）显微镜系统，现在有两个模块：带HC F模块的照明光学元件的放大倍数为11.5，对于HC RF模块，放大倍数为4.8。此外，徕卡DM R（HCS）落射照明支架带有一个额外的照明透镜，与HC F模块结合使用，可在25 mm的视场中产生非常高的荧光强度和良好的均匀性。需要特别好的同质性的用户甚至可能会脱离HC F模块的照明透镜，这只会稍微降低荧光强度。物镜中的光源的图像比例从11.5减小到大约9.5，导致有效视场增加约20％。为了进一步提高均匀性，可以将光学扩散盘插入模块中。有趣的是，已经观察到，当图像强度不是恒定而是稍微下降到图像边缘时，可获得用于观看荧光的最令人愉快的图像印象。这种作用是眼睛生理的结果（所谓的“侧向延迟”）。相反，具有图像分析功能的视频技术需要非常恒定的照明。这可以通过将HC RF模块中的光学扩散盘切换到视频模式来实现，从而在大约16mm的中心场中获得更高的均匀度（对应于1/2英寸带有电视适配器的相机所覆盖的区域x0 .5）。
　　徕卡还进一步改善了荧光显微镜的物镜。具有低自发荧光性质的光学玻璃的选择导致图像对比度的增强。
　　荧光显微镜的一个问题是无法从相对较厚的样品中获得清晰的图像。这是由于使用高数值孔径的物镜，焦前和焦后平面对最终显微镜图像的有害影响。这样会导致图像清晰度不高。然而，Leica光谱共聚焦显微镜可以以高横向和垂直分辨率从标本中的几个焦平面获得高分辨率拍摄的清晰图像。
　　样品中多种荧光染料的分色已通过光谱分析得到了进一步改善。因此，计算机辅助光谱共聚焦扫描显微镜已成为生物医学和材料研究中荧光显微镜的工具。
　　过去十年中，分子生物学应用的爆炸式增长导致了针对各种应用的许多过滤器组合的发展。现在，这些过滤器集安装在各种过滤器立方体（块）中。荧光落射照明器可以通过手动操作或电动更换来更换2-8个滤光片，例如荧光杂交研究中所需要的。本文无意对各种过滤器立方体支持的多种应用进行全面详细的讨论。相反，仅给出了过滤器多维数据集和关键字的示意图，指出了可能的应用（表1）。
　　当在引用的论文中提及光学零件和荧光染料时，此处仅列出它们。该表中的语言和术语于所引用论文的文本中使用的术语。斜体列出了德语的过滤器名称术语。作者可以将带干扰滤波器的半宽度（BP）称为+00或/ 00 nm，表示中心波长和半功率带宽（例如BP 525/20）或短波和长波半功率点（例如BP 450–490）。短通和长通滤波器由字母SP和LP以及以nm为单位的边沿波长（例如SP490，LP 520或> 520 nm）标识。对于作者向光学部件制造商的参考，读者可以参考所引用的文献。
　　显微镜，物镜，大分子文献参考
　　荧光色素
　　光源激发滤光片
　　二向色分束器滤光片
　　发射过滤器
　　激光扫描显微镜（LSC）x20表面标记DNA染色Körnemann等人：Cytometry 41：172-177（2000）
　　FITCPI
　　氩激光蓝488 nm*
　　530 + 30 nm&BP green625 + 28 nm&BP red
　　倒置荧光显微镜x40荧光寿命成像Murata等：Cytometry 41：178–185（2000）
　　何7-AAD
　　DCM激光UV 335 nm*
　　FT 395％（DM，DBS）
　　450 + 33 nm&BP紫
　　数字荧光显微镜x100 / 0.60–1.32，SP（KP）630位于CCD摄像机前，可阻挡远红光和红外光PNA FISHde Pauw等人：Cytometry 32：163-167（1998）
　　CY3DAPI
　　绿色515–560&
　　UV 340–380& nm BP
　　LP 580红＃LP 430蓝色＃
　　共焦荧光显微镜x60 / 1.4光漂白研究van Oostveldt et al .: Cytometry 32：137–146（1998）
　　FITC
　　Ar+-离子线蓝色488 nm* BHS&
　　LP OG 530＃黄色
　　数字荧光显微镜x63 / 1.4激发滤光轮染色体研究Poon等：Cytometry 36：267-278（1999）
　　DAPICy3
　　混合/氙气汞灯405* nm紫色546* nm绿色DAPI / Cy3滤光片组
　　荧光显微镜染色体的瘤内异质性da Vinci等：Cytometry 37：369-375（1999）
　　TRITCFITCDAPI
　　三重带通滤波器*（MBP）
　　调频百分比
　　（发射）
　　荧光显微镜x100 / 1.35柔螯合Bour-Dill等人：细胞计数法39：16–25（2000）
　　LB柔NBDDiOC
　　汞灯100WBP 330–385&
　　BP 460–449&
　　BP 460–490&
　　DM 410％DM 570％DM 510％
　　（发射）BP 430–460$LP 590＃BP 510–550$
　　荧光显微镜自动彗星测定Böcker等：Cytometry 35：134–144（1999）
　　PI
　　汞灯100 WSP 580^
　　E2@
　　（发射）LP 590＃
　　电动落射照明器x100 / 1.3，使用多色FISH进行的染色体研究Kuzobek等人：Cytometry 36：279-293（1999）
　　DAPIFITC德克萨斯红
　　汞灯100 W紫外线蓝绿色
　　四个过滤立方体@（FC）
　　（发射）BP 425@蓝色BP 525@绿色BP 615@红色
　　倒置荧光显微镜，CCD染色体三色成像Coco-Martin等人：Cytometry 32：327-336（1998）
　　DAPIFITCTRITC
　　紫外线BP 365/12&
　　BP 450–490&
　　BP 546/12&
　　发射> 379＃ nm> 520＃ nm> 593＃ nm
　　数字荧光显微镜和（CCD）x40 / 0.75对粒细胞的图像分析Szecs等人：Cytometry 33：19-31（1998）
　　R 123EB
　　多带通滤波器（MBP）490 〜nm的蓝色570 〜nm绿色
　　三通（多色）分束器（PBS）％〜
　　三通带发射滤波器520〜nm580〜nm
　　带有电动落射照明器，延迟发光成像和CCD的荧光显微镜，x63 / 1.32FISH核型分析Tanke等人：Cytometry 33：453-459（1998）
　　cascade bl
　　FLRCy5Cy7铂卟啉
　　汞灯100 WBP&500–560 nm
　　A@
　　HQ-FITC@
　　HQ-TRITC@
　　HQ-Cy5@
　　HQ-Cy7@
　　DBS 580@ nm
　　BP$600–700 nm
　　带有电动滤镜更换器和CCD摄像头的荧光显微镜FISH Morrison和Legator中的两种颜色比率方法：细胞比色法27：314–326（1997年）
　　DNA探针：1绿色2橙色（1）WCP（2）CEP
　　BP&510/20 nmBP&572/18 nm
　　三通（多色）分束器（PBS）％〜
　　三通带通的发射滤光片：MBP〜535nmMBP〜606nm

　　带有CCD照相机的荧光显微镜比较基因组杂交Bornfleth等人：Cytometry 24：1–13（1996）
　　DAPIFITC德州红
　　汞灯50 W三重带通激发滤波器
　　三通带通发射滤波器
　　荧光显微镜和CCD相机，x20 / 0.75核图像的分割Price等人：Cytometry 25：303-316（1996）
　　DAPI
　　汞灯100 WBP&365/10
　　DM％400nm
　　没有
　　带有CCD摄像机的显微镜x30 / 0.5，使用标记的单克隆抗体对淋巴细胞进行多参数荧光成像Galbraith等人：《细胞计量学的新技术》，刊载于：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：3587-8404。SPIE 1063（1989）
　　FITCPECy5Cy3
　　手动，用于荧光滤光片的六个位置滑块
　　使用多色分束器Heiden和Tribukait进行波长切换的落射照明显微镜专用光学系统：Cytometry 20：95-101（1995）
　　DAPITRITC
　　汞灯100 WBP&365/33 nmBP&546/23 nm
　　多色PBS％365反射546反射
　　BP$435–500 nmBP$500–750 nm
　　*发射或激光线。^短波SP（KP）激发滤波器。＆窄带通（BP）激发滤波器。〜多带通滤波器（MBP）。％二向色分束器（DBS）或二向色镜（DM）和％〜多色分束器（PBS）。＃屏障过滤器（LP）。$发射带通（BP）干扰滤波器和发射多带通滤波器（MBP）。@过滤器立方体，块（FC）。
　　徕卡在落射照明显微镜的发展已经导致了进一步的发展：反射对比显微镜。反射对比显微镜从标有常规吸收性免疫标记（例如过氧化物酶-DAB，免疫金-银和免疫磷酸酶）的标本中提供了强信号（图10和11）。由于可以获得的信号-高图像对比度，并且聚焦前和聚焦后图像均不会降低图像质量-薄截面的RCM满足了所有理论光学标准，可实现光学显微镜分辨率。光学结果可以定义为高清晰度图像。

　　图10：反射对比显微镜（RCM）。小鼠腹膜巨噬细胞粘附在盖玻片上，并用针对表面抗原的单克隆抗体染色。免疫过氧化物酶染色。由于DABox产品的强烈影响，可见到丝状伪足的细小延伸，在明视野显微镜下是不可见的。

　　图11：肾脏组织的超薄切片（约35 nm）：过氧化物酶DAB染色。反射对比显微镜观察到的肾小球的线性染色模式通常比荧光显微镜观察更清晰的图像。

　　图12：用于反射对比显微镜的滤光片立方体（块），包含一个偏振器，一个中性（50％）分束器和一个分析仪。可以将这个滤光块（块）插入Leica Epi照明器的一个位置以进行荧光显微镜检查
　　大多数免疫染色的强烈反射提供了很高的对比度，因此该染色可以与许多经典的（吸收性）组织化学染色相结合，用于显示中等强度反射的重要大分子。后一种染色剂通常可用于提供良好的形态学取向，并且在许多情况下，与仅使用荧光标记物相比，可以获得更精确的免疫标记物位置。此外，可以通过电子显微镜检查下一个超薄切片（具有相同的免疫染色）并用EM确认这种光学显微镜观察。
　　在共聚焦激光扫描显微镜中，由于通过针孔照明消除了杂散光，因此无需特殊的物镜或其他减少杂散光的光学措施即可执行RCM。大多数吸收性免疫染色会产生强烈的激光反射，并且褪色非常有限。它们通常允许使用较小的针孔尺寸（例如10微米），该尺寸比共聚焦荧光激光扫描显微镜中大多数荧光染料的针孔尺寸小约五到十倍。因此，使用反射免疫标记可以导致光学分辨率的显着提高。标本用荧光染料和Leica光谱共聚焦激光扫描显微镜双重染色，为多种标记提供了新的可能性，可以轻松检查反射型免疫标记。
　　RCM使用荧光显微镜支架，落射照明器和高压灯。在荧光落射照明器中，必须插入一个额外的偏振滤光镜立方体，其中包含一个偏振镜，反射镜和一个检偏镜（图12）。同样，反射对比度（RC）光阑模块（包含光阑系统）也必须带入入射光路。此RC膜片模块适用于带有挡块和/或光圈膜片的滑动装置。此外，为反射对比显微镜开发的特殊物镜，Leica RC M-plan油浸式x100 / 1.25 RCM物镜，在前透镜处装有λ/ 4板，应添加到物镜组（用于荧光显微镜）上。物镜的炮塔。
　　在反射光显微镜中，对比度基于反射强度（=反射率）的差异。在这种类型的显微镜中，应提醒注意的是，光的反射发生在每个光学边界处，即当折射率和/或吸收率发生变化时。对于显示出小于1％且大多数小于0.2％的反射率的生物样本，由于显微镜镜筒内部有害的反射，几乎不可能用常规显微镜获得反射光图像。在反射对比显微镜中，两种方法的组合用于减少由于散射光引起的眩光。通过插入光阑（装有光阑的孔径光阑，在与物镜的后焦（孔径）平面共轭的平面上在入射光路径中产生一个环形孔）。作为第二种方法，通过使用“ antiflex”方法减少了不需要的散射反射光。使用交叉偏光镜可抑制显微镜内部反射的光，结果只有从样品反射的光才能传递到眼睛。为此目的，在物镜的前透镜中为物镜提供了一个四分之一波片。光通过λ/ 4板（向下到达样品，并在样品反射后向上），使光的偏振方向改变为2 x 45°= 90°。

值得收藏